Dialyse

Dialyse: Funktionsweise, Abhängigkeiten und Anwendungen

Dialyse ist ein diffusionsbasierter größenselektiver Transport von Molekülen oder anderen Partikeln durch eine semipermeable Membran von einer hohen zu einer niedrigeren Konzentration. Die Selektivität der Dialyse wird bestimmt von der Porengröße der semipermeablen Membran. Die Dialyse ist ideal geeignet zur Trennung von größeren Molekülen (z.B. Proteine) und deutlich kleineren Molekülen (z.B. Salze).

 

Funktionsweise Dialyse

Abbildung 1: Prinzip der Proben-Dialyse

 

In Abbildung 1 ist der Dialysevorgang in einem Dialyseschlauch beispielhaft dargestellt. Eine Proteinlösung enthält nach der Reinigung mittels FPLC eine höhe Konzentration an NaCl, was jedoch in anschließenden Arbeitsschritten störend ist. Die Proteinprobe wird in das Dialysegefäß pipettiert und in ein großes Volumen Dialysepuffer (Wasser) eingebracht. Sowohl Protein- als auch NaCl liegen im Vergleich zum Dialysepuffer (Wasser) in der Probe in einer deutlich höheren Konzentration vor und stehen über die Membran in Verbindung. Auf Grund ihrer Größe können nur NaCl-Ionen die Membran passieren und Proteine werden zurückgehalten. Die Konzentration an NaCl in der Probe wird kontinuierlich reduziert bis zu einem Konzentrationsgleichgewicht zwischen Probe und Puffer.

Dieser diffusionsgetriebene Vorgang läuft im Vergleich zu anderen Trennverfahren relativ langsam ab. Dadurch treten keine schnellen Konzentrationsänderungen und Konzentrationssättigungen auf, die zur Ausfällung der Proteine in der Probe führen können. Für Renaturierungs- und Rückfaltungsversuche von Proteinen und zur Erhaltung der Proteinaktivität ist in der Regel die langsame Änderung der Versuchsbedingungen von Vorteil. Ebenso fällt das Zusetzten der Membranporen (membrane clogging) im Vergleich zur Ultrazentrifugation deutlich geringer aus und im Vergleich zur Gelfiltration treten nur geringe Volumenänderungen auf. Damit ist die Dialyse ein schonendes, mit geringen Verlusten behaftetes Verfahren zur Trennung von Molekülen anhand ihrer Größe.

Der Vorteil der langsamen Diffusion ist jedoch gleichzeitig ein Nachteil. Die Prozesszeiten sind vergleichsweise lang. Weiterhin ist die Handhabung von klassischen Dialyseschläuchen aufwendig und nur für wenige Proben geeignet. Eine spezielle Laborausrüstung ist jedoch nicht notwendig.  Am Markt sind jedoch heutzutage Dialysatoren erhältlich, die eine einfache Bedienung ermöglichen und für hohe Probenzahlen geeignet sind. Dazu zählen auch die Xpress Dialyzer der Firma scienova.

Die Diffusion ist ein Ergebnis der temperaturabhängigen zufälligen Brown’schen Molekularbewegung. Das führt zur Angleichung von Konzentrationsgradienten bis zum Gleichgewicht. Der Fluss der Moleküle und Partikel wird im Fick‘s ersten Gesetz beschrieben.

J: Diffusionsfluss
D: Diffusionskoeffizient
c: Konzentration
x: Diffusionslänge

Wichtige Einflussgrößen auf die Dialyse sind:

Konzentrationen

Die Dialysegeschwindigkeit ist abhängig vom Konzentrationsgradienten, der zu Beginn der Dialyse am größten ist. Im Laufe der Dialyse verringert sich der Konzentrationsgradient zwischen Probe und Dialysepuffer. Um eine hohe Dialysegeschwindigkeit beizubehalten, empfiehlt es sich ein großes Proben- zu Puffervolumenverhältnis zu verwenden. Beispielsweise bietet die scienova Xpress Magnetic Mixing Dialysis Box ein größeres Puffervolumen im Vergleich zur Deep Well Platte. Als zweite Möglichkeit bietet sich der regelmäßige Puffertausch an, um das Konzentrationsgefälle groß zu halten. Eine Empfehlung wäre der Puffertausch alle 30 bis 60 Minuten beim Entsalzen mittels den scienova Xpress Micro Dialyzern.

Temperatur

Die Dialysegeschwindigkeit ist größer bei höheren Temperaturen. Jedoch begrenz die Toleranz der Proben gegenüber höheren Temperaturen in den meisten Fällen den Einsatz über die Raumtemperatur hinaus. Besonders empfindliche Proben sollten daher bei 4 °C dialysiert werden, damit Denaturierungs- oder Aktivitätsverluste der Proben vermieden werden. Dabei sollte beachtet werden, dass Probe und Puffer nicht gefrieren und die Dialysegeschwindigkeit verlangsamt ist.

Dialysezeit

Die Dialysegeschwindigkeit wird durch zahlreiche Faktoren beeinflusst: Substanzen, Konzentration, Membran, Diffusionsstrecke oder Temperatur. Viele Hersteller stellen Anwendungsbeispiele zur Verfügung, die als Basis für die Optimierung der Dialysebedingungen herangezogen werden können. Die Durchführung von Vortests ist angeraten, um ein optimales Protokoll zu finden.

Membran

Der Fluss durch die Membran ist abhängig von der aktiven Membranfläche, dem Verhältnis der aktiven Membranfläche zum Probenvolumen, der Porengröße sowie Porosität. Dabei erhöht sich die Dialysegeschwindigkeit mit einem größeren Verhältnis an Membranfläche zu Probenvolumen, höherer Porosität und weiteren Poren.

Ein wichtiger Aspekt ist außerdem, dass an der Membran unspezifisch Substanzen binden können, was zu Verlusten der Probe führen kann. Cellulose-basierenden Dialysemembranen sind als wenig bindendes Material bekannt, sollten aber geprüft werden, wenn Probenverluste auftreten.

Diffusionsstrecke

Die Dialysezeit steigt exponentiell mit der Diffusionsstrecke. Deshalb sollte ein Dialysegefäß mit kurzen Diffusionsstrecken gewählt werden. Beispielsweise besitzen die scienova Xpress Dialyzer eine speziell entwickelte Geometrie, die hohe Dialysegeschwindigkeiten gewährleistet. Schütteln oder Rühren der Lösungen erhöht den Transport der Verbindungen.

Abbildung 2: Vergleich der Dialysegeschwindigkeiten bei verschiedenen Diffusionsstrecken: Dargestellt wird die Konzentrations-Abnahme der farbigen Verbindung p-Nitrophenol in Micro Dialyzern. Scienova Xpress Micro Dialyzer MD100 (0,75 mm Diffusionsstrecke) und MD300 (1,5 mm Diffusionsstrecke), Probe: 1 mM p-Nitrophenol, Dialysepuffer: 1x PBS pH 7,4, Dialysezeit: 30 min., Absorption gemessen bei 420 nm (Tecan Sunrise Photometer)

 

Dialysepuffer

Der Dialysepuffer steht im Kontakt mit der Dialyseprobe und kleine Verbindungen des Puffers können die Dialysemembran passieren. Der gewählte Dialysepuffer sollte kompatibel mit den geplanten Reinigungsschritten sein und kann zur Stabilisierung des pH-Wertes verwendet werden. Wenn die Probe eine hohe Konzentration an niedermolekularen Substanzen enthält (z.B. Saccharose), kann es aufgrund des osmotischen Drucks zu einem Wassereinstrom in die Probe und zu einer deutlichen Volumenzunahme führen. Häufig verwendete Puffer sind Phosphatpuffer, TRIS, MOPS und HEPES.

Probe

Die Diffusionsgeschwindigkeit ist abhängig von der Molekülgröße (in Lösungen hydrodynamischer Durchmesser). Deshalb ist die benötigte Dialysezeit für Salze geringer als für Farbstoffe mit typischen Molekulargewichten von 200–500 Dalton. Empfehlenswert ist ein Größenverhältnis der zu trennenden Substanzen von 25:1.

Anwendungen der Dialyse

Die Dialyse eignet sich für eine Vielzahl an Anwendungen:

Damit ist die Probendialyse nicht nur ein schonendes Verfahren zur Trennung von Molekülen, sondern auch für zahlreiche Anwendungsszenarien einsetzbar und nicht aus dem modernem Laboralltag wegzudenken. Neben dem bekannten Dialyseschlauch existiert auch eine große Auswahl an Dialysekartuschen für Forschungs- und Analyselabore.

       
"Entwicklung einer Verwertungsstrategie für Xpress Dialyzer Produkte von scienova" gefördert durch den Freistaat Thüringen aus Mitteln des Europäischen Sozialfonds